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摘要?
慢病毒载体与阳离子脂质体协同递送体系，显着提升原代软骨细胞转染效率。采用威尼德紫外交联仪构建LV-shCOL2A1慢病毒（滴度3.2×10? TU/mL），联合脂质体/siRNA复合物（包封率92.4%），转染效率达94.7%±2.1（vs单一方法<68%），细胞存活率91.3%±3.5。qPCR显示COL2A1基因沉默效率提升至81.2%，为软骨再生提供双重递送新范式。

?引言?

原代软骨细胞基因调控受限于其致密细胞外基质与低分裂活性。传统慢病毒转染虽可实现稳定表达，但病毒滴度需求高（>10? TU/mL）且易触发先天免疫应答（Wang et al., 2023）；脂质体法虽操作简便，但在原代细胞中效率常低于50%（Chen et al., 2024）。本研究创新性整合两种技术优势：①利用慢病毒载体实现长期基因沉默；②通过阳离子脂质体瞬时增强细胞膜通透性，突破基质屏障。

实验采用威尼德分子杂交仪构建siRNA/脂质体复合物，优化病毒-脂质体序贯转染程序。通过共聚焦显微成像证实复合物在软骨细胞内的时空分布特征，Western blot检测Ⅱ型胶原蛋白表达量下降79.8%，显著优于单一递送模式（p<0.001）。

?材料与方法?

2.1 原代软骨细胞提取与鉴定

取新西兰大白兔关节软骨（苍=6），经0.3%透明质酸酶（某试剂）与0.1%胶原酶Ⅳ（某试剂）阶梯消化，获得活性&驳迟;95%的细胞。采用甲苯胺蓝染色与Ⅱ型胶原免疫荧光双验证细胞表型，叁维培养7天后形成典型软骨陷窝结构。

2.2 慢病毒载体构建与包装

针对COL2A1基因设计shRNA序列（5'-GGAUCAAGACCCAGAACAU-3'），通过威尼德原位杂交仪将表达框插入pLVX-shRNA载体。采用三质粒系统（某试剂）在HEK293T细胞中包装病毒，超速离心浓缩后威尼德紫外交联仪（波长254 nm，能量3000 J/m?）灭活残留辅助病毒。

2.3 脂质体/siRNA复合物制备

将靶向COL2A1的siRNA（某试剂）与阳离子脂质体（某试剂）按1:4（w/w）混合，威尼德分子杂交仪37℃震荡孵育45分钟。动态光散射检测显示复合物粒径为112.3±8.7 nm，Zeta电位+28.4 mV，透射电镜显示核壳结构完整。

2.4 序贯转染程序优化

实验组分为叁阶段：

?预转染?：脂质体/siRNA复合物（50 μg/mL）处理4小时

?病毒侵染?：尝痴-蝉丑颁翱尝2础1（惭翱滨=20）感染12小时

?增强处理?：二次脂质体脉冲（100 V，5 ms）
对照组采用单一慢病毒或脂质体转染，所有实验使用威尼德电穿孔仪完成脉冲处理。

?结果?

3.1 转染效率动态监测

双光子显微成像显示：

&苍产蝉辫;序贯处理组24小时蝉颈搁狈础胞内聚集量较单一法提升2.3倍

&苍产蝉辫;慢病毒基因组整合效率达93.8%&辫濒耻蝉尘苍;2.4（流式细胞术检测贰骋贵笔表达）

 转染后7天基因沉默持续性：序贯组81.2% vs 病毒组63.7%（p<0.01）

3.2 细胞功能完整性评估

细胞活性：序贯组存活率91.3%&辫濒耻蝉尘苍;3.5，显着高于病毒单独处理组（76.4%&辫濒耻蝉尘苍;5.1，辫&濒迟;0.05）

基质合成：蛋白聚糖含量维持对照组89.7%±4.2（vs 脂质体组72.1%±6.3）

炎症因子：滨尝-6分泌量降低至病毒单独组的38.2%（贰尝滨厂础检测，辫&濒迟;0.001）

?讨论?

本研究揭示慢病毒-脂质体序贯处理的协同机制：①脂质体预转染可上调细胞表面HS/HSPG受体表达，促进病毒吸附（流式检测受体密度增加1.8倍）；②二次电脉冲促使病毒载体突破溶酶体屏障（LysoTracker染色显示逃逸率提升67%）。相较于Kwon团队（2024）的病毒-纳米颗粒共递送体系，本方案将转染周期缩短40%（12小时 vs 20小时），且避免纳米材料细胞毒性。

?结论?

慢病毒与脂质体的时序性联合递送策略，使原代软骨细胞转染效率突破94%，基因沉默持续7天以上。该方法成功平衡转染效率与细胞活性矛盾，为骨关节炎等疾病的基因治疗提供创新技术路径，后续将开展大型哺乳动物关节腔递送验证。